رفع كفاءة تحليلELISA:دور تجارب Spike and Recovery و Linearity of Dilution في تعزيز الدقة والموثوقية
في هذا المقال، اكشف الأساليب الفعّالة التي تُحسّن دقة تقنية ELISA، وهي تقنية رئيسية في مجال الكيمياء الحيوية. يُسلط المقال الضوء على تجارب الزيادة والاسترداد وخطية التخفيف كوسائل رئيسية لتقييم وتحسين أداء هذه التقنية. سيتم شرح كل تقنية بشكل مفصل، مع التركيز على كيفية تنفيذها وكيف يمكن استخدام النتائج لضمان تحليل دقيق وموثوق. يهدف المقال إلى توفير فهم شامل للقراء حول الأساليب التي يمكن اعتمادها لتعزيز جودة تقنية ELISA وضمان استخدامها بكفاءة في مجالات البحث العلمي والتشخيص الطبي.
تقنية الـ ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) هي تقنية تستخدم في مجال الكيمياء الحيوية لكشف وقياس التفاعل بين الجزيئات البيولوجية، مثل البروتينات والهرمونات والأجسام المضادة. يتم استخدام ELISA بشكل شائع في مجالات مثل الطب وعلم الأحياء الجزيئي والتشخيص الطبي.
العملية تبدأ بتحضير صفائح أو ألواح (plates) تحتوي على جزيئات هدف مرغوبة، على سبيل المثال، البروتين المراد قياسه. يتم تعريض هذه الصفائح لعينة محتملة تحتوي على الجزيئات المراد قياسها. إذا كان هناك تفاعل بين الجزيئات المراد قياسها والجزيئات الموجودة على الصفائح، يتكون مركب مرئي أو ملموس يمكن قياسه.
تتضمن الخطوة التالية إضافة مركب كيميائي يحتوي على إنزيم مرتبط بجزيء مضاد (antibody)، والذي يتفاعل مع الهدف المرغوب. إذا تم تشكيل التفاعل، يمكن قياس الإنزيم المرتبط بالمستضد باستخدام مواد كيميائية خاصة. كلما زادت كمية الهدف في العينة، زادت كمية الإنزيم المضافة، مما يتيح للباحثين قياس التركيز بدقة.
تقنية ELISA تستخدم على نطاق واسع في تشخيص الأمراض، فحص المستضدات، وتحديد تراكيز البروتينات، مما يجعلها أداة قيمة في البحوث الطبية والتطبيقات الطبية.
تعتبر تجارب الاستعادة والزيادة spike والتخفيف من الأساليب الهامة لتحقيق صحة وتقييم دقة تقنيات ELISA وتقنيات التحليل الأخرى لأنواع محددة من العينات. يتم استخدام التجربة لتحديد ما إذا كان اكتشاف المحلل يتأثر بالفرق بين المواد المخففة المستخدمة لإعداد المنحني القياسي ومصفوفة العينة البيولوجية. [مصفوفة العينة إما أن تكون عينة بيولوجية صافية (أي غير مخففة) أو مزيجًا من العينة مع مخفف العينة]. تقنية التخفيف تشير إلى قدرة التنبؤ بالاسترداد الطبيعي أو الاصطناعي لعوامل التخفيف المعروفة في نطاق الاختبار المرغوب. ويمكن تصميم التجارب لاختبار استرداد الاصطناع وخطية التخفيف في وقت واحد. يتناول النقاش التالي كل منهما بشكل منفصل.
الزيادة والاسترداد Spike and Recovery
أ. المعنى والغرض من تقييم الزيادة والاسترداد
في التجربة ذات الزيادة والاسترداد، يتم إضافة كمية معروفة من المحلل (spiked) إلى مصفوفة العينة الاختبارية الطبيعية، ويتم قياس استردادها (recovered) في الاختبار عن طريق مقارنتها بزيادة مماثلة في المخفف القياسي. تشمل طرق ELISA مقارنة العينات الاختبارية بمنحنى قياسي يتم إعداده باستخدام تراكيز معروفة من المحلل (على سبيل المثال، البروتين المركب المنقى). الهدف في تطوير الاختبار هو تحقيق أقصى نسبة الإشارة إلى الضوضاء (signal to noise ratio) مع تحقيق استجابات متطابقة لكميات معينة من المحلل في المخفف القياسي (المنحنى القياسي) ومصفوفة العينة (العينة + مخفف العينة). قد تحتوي مصفوفة العينة على مكونات قد تؤثر على استجابة الاختبار للمحلل بشكل مختلف عن المخفف القياسي. يتم تصميم تجربة الزيادة والاسترداد لتقييم هذا الاختلاف في استجابة الاختبار.
ب. أداء تجربة الزيادة والاسترداد
لأداء تجربة الزيادة والاسترداد، يتم إضافة كمية معروفة من المحلل إلى مصفوفة العينة والمخفف القياسي، ويتم مقارنة الاستجابتين بناءً على القيم المحسوبة من منحنى قياسي. إذا كانت الاسترداد المرصود للزيادة متطابق للاسترداد الناتج عن المحلل الذي أعد في المخفف القياسي، تعتبر مصفوفة العينة صالحة لإجراء الاختبار. إذا كانت الاسترداد مختلف، فإن المكونات في مصفوفة العينة تسبب هذا الاختلاف، ويجب إجراء تعديلات على الطريقة لتقليل الاختلاف.
ج. التعديلات على النتائج السيئة في تجربة الزيادة والاسترداد
يمكن إجراء نوعين من التعديلات لإعادة تحسين طريقة ELISA عندما تكتشف تجربة الزيادة والاسترداد اختلافًا بين المخفف القياسي ومصفوفة العينة. إحدى الاستراتيجيات هي استخدام المخفف القياسي الذي يتطابق أكثر في تكوينه مع مصفوفة العينة النهائية.
على سبيل المثال، يمكن استخدام وسط مغذي كمخفف إذا كانت العينات ستستخدم كرائق supernatants للبيئة المغذية. إذا كان المخفف قد تم تحسينه سابقًا لأداء نسبة الإشارة إلى الضوضاء، فإن تغيير المخفف ليتناسب مع أداء مصفوفة العينة سيؤدي إلى تقليل نطاق الاختبار أو الحساسية أو نسبة الإشارة إلى الضوضاء. في بعض الحالات، قد يكون هناك حاجة إلى تحقيق حلاً توفيقيًا (وسطي) لتقدير النتائج.
الاستراتيجية الثانية لتصحيح الاختلاف بين المخفف القياسي ومصفوفة العينة هي تعديل مصفوفة العينة. إذا تم استخدام عينة بيولوجية نقية، يمكن إعادة اختبارها بعد تخفيفها في المخفف القياسي أو مخفف عينة منطقي آخر. على سبيل المثال، إذا كانت عينة مصل غير مخففة تنتج استردادًا وزيادة ضعيفين، ربما ستعمل تلك التي تم تخفيفها بنسبة 1:1 في المخفف القياسي بشكل أفضل. إذا كانت مستويات المحلل في العينة المخففة كافية ليتم اكتشافها بواسطة الاختبار، فإن هذه الطريقة ستصحح العديد من مشكلات الاسترداد. يمكن الحصول على نتائج أفضل لمصفوفة العينة عن طريق تغيير درجة الحموضة فيها (على سبيل المثال، لتتناسب مع المخفف القياسي المحسن) أو عن طريق إضافة بروتين محدد ومنقى مثل BSA كحامل/مثبت. يجب أن تأخذ في اعتبارك أن أفضل مخفف للعينة لا يكون بالضرورة هو نفسه المخفف القياسي الأفضل؛ على سبيل المثال، تحتوي عينات المصل على كمية كبيرة من البروتينات (مثل الألبومين) في حين أن البروتين المركب المنقى المستخدم كمعيار قد لا يحتوي على أي بروتين حامل. في هذه الحالة، قد يكون المخفف القياسي الأفضل هو محلول الفوسفات المعقم (PBS) الذي يحتوي على 1% BSA، بينما قد يكون مخفف العينة الأفضل للمصل هو PBS بدون أي بروتين إضافي.
خطية التخفيف Linearity of Dilution
أ. الغرض من تقييم خطية التخفيف
توفر تجربة خطية التخفيف معلومات حول دقة نتائج الاختبار للعينات التي تم اختبارها على مستويات تخفيف مختلفة في مخفف العينة المختار. يتم تعريف الخطية بالنسبة إلى الكمية المحسوبة من المحلل بناءً على المنحنى القياسي، وليس بالنسبة إلى قياسات الامتصاص الخام (أفضل منحنى قياسي يكون عادة غير خطي). إذا كانت الخطية جيدة على مدى واسع من التخفيف، فإن طريقة الاختبار توفر مرونة في اختبار العينات ذات مستويات مختلفة من المحلل (على سبيل المثال، يمكن تخفيف عينة تحتوي على مستويات عالية من المحلل بعدة مرات لضمان أن قيمها تقع ضمن نطاق المنحنى القياسي وتقارن بعينة ذات مستوى منخفض يتم اختبارها بدون تخفيف).
ب. أداء تجربة خطية التخفيف
هناك طريقتان لأداء تجربة خطية التخفيف. الطريقة الاولى تتضمن استخدام عينة ذات مستوى منخفض تحتوي على زيادة معروفة من المحلل (أو عينة ذات تركيز عالي بدون زيادة)، ثم اختبار عدة تخفيفات مختلفة لتلك العينة في مخفف العينة المختار. الطريقة البديلة تتضمن تحضير عدة تخفيفات مختلفة أولاً لعينة ذات تركيز منخفض ومن ثم إضافة نفس الكمية المعروفة من المحلل إلى كل منها قبل الاختبار. يتم تقييم استرداد الاختبار عن طريق مقارنة القيم المرصودة مقابل القيم المتوقعة بناءً على العينات غير المعززة و/أو العينات الصافية (غير المخففة).
ج. تفسير نتائج خطية التخفيف
تشير خطية التخفيف الضعيفة إلى أن مصفوفة العينة الطبيعية، ومخفف العينة و/أو المخفف القياسي يؤثرون على قابلية اكتشاف المحلل بشكل مختلف. يمكن أن يكون سبب هذا الاختلاف هو تخفيف المكونات التي تعيق أو تعزز الكشف في طريقة الاختبار مقارنة بالحلول الأخرى. لذلك، تكمن أسباب خطية التخفيف الضعيفة في نفس أسباب انخفاض استرداد الاختبار. الهدف في أي حالة هو تحقيق تكافؤ بين المنحنى القياسي ومصفوفة العينة (سائل العينة الصافي ومخفف العينة). إذا كان ذلك مرغوبًا، يمكن إجراء تجربة واحدة باستخدام مصفوفة تحقق فيها مستويات الزيادة وأنواع العينات ومخففات العينات وعوامل التخفيف لتقييم استرداد الاصطناع وخطية التخفيف في وقت واحد.
يوضح الجدول 1. زيادة واسترداد الـ ELISA لبروتين IL-1ß البشري المركب في تسع عينات من البول البشري. تم اختبار العينات بإضافة 50 ميكرولتر من العينة و 10 ميكرولتر من محلول الزيادة المحسوب لتحقيق تركيز زيادة المقصود 0، 15، 40 أو 80 بيكوغرام/مل. تعكس القيم المُبلَغَ عنها للعينات المعززة الطرح للقيمة الطبيعية (بدون زيادة) وتم حساب الاسترداد للعينات الاختبارية المعززة بالمقارنة مع الاسترداد المقاس للتحكم في المخفف. تُمثل جميع القيم متوسط ثلاث مرات تكرار.
