التطوير والتحقق من طريقة مؤشر الثبات SIM في التحليل الدوائي: أساليب وأدوات لضمان الجودة

الخطوة الأولى: توليد عينات متحللة لاختبار انتقائية الطريقة Generation of degraded samples for testing selectivity of the method

وفقًا لإرشادات إدارة الغذاء والدواء الأمريكية  FDA  (الإرشادات الموجهة للصناعة)، الإجراءات التحليلية والتحقق من صحة الطرقAnalytical Procedures and Methods Validation، تم تعريف طريقة مؤشر الثبات (SIM) Stability Indicating Method على أنها إجراء اختبار تحليلي للببتيدات تم التحقق منه بدقة ويقيس بدقة المكونات النشطة (المادة الدوائية أو المنتج الدوائي) بعيدًا عن الشوائب والمكونات الإضافية ومنتجات التحلل. توصي إدارة الغذاء والدواء بأن تكون جميع إجراءات التحليل للثبات مؤشرًا للاستقرار. الهدف الرئيسي لطريقة مؤشر الثبات هو مراقبة النتائج خلال دراسات الثبات لضمان السلامة والفعالية والجودة. كما تمثل أداة قوية عند التحقيق في النتائج الخارجة عن الدارج (OOT) أو الخارجة عن المواصفات (OOS) في عمليات التحكم بالجودة.

يجب أن تولد اختبارات الإجهاد عينات تمثيلية لتقييم ثبات المادة الدوائية والمنتج الدوائي، وتوفير معلومات حول مسارات التحلل المحتملة، وإظهار قوة الطريقة التحليلية المستخدمة في تحديد الثبات. يتم تقييم حدود الكشف (LoD) وحدود التحديد (LoQ) للطريقة بما يتناسب مع تحديد كمية التحلل. يجب أن تكون هذه الحدود مرتبطة بشكل وثيق بالتبليغ والتعرف والتأهيل لمنتجات التحلل، كما هو مذكور في ICH Q3B (R2). يتم تحديد هذه العتبات إما كنسبة مئوية من المادة الدوائية أو استهلاك المنتج المتحلل اليومي الكلي (TDI) .

الخطوة 2: تطوير الطريقة (التلاعب وتقييم الانتقائية/التحديد) method development (manipulating and evaluating selectivity/specificity)

الكروماتوغرافيا السائلة هي التقنية الأنسب لتطوير/التحقق من طريقة مؤشر الثبات  (SIM) . استخدام كاشف الدايود المصفوفيdiode-array-detector، بالإضافة إلى أجهزة قياس الطيف الكتلي mass spectrometers، يوفر أفضل أداء للأشخاص الذين يعملون على تطوير مؤشر الثبات. الهدف هو التلاعب بالانتقائية عن طريق تغيير تركيبة الطور المتحرك، وطول موجة الكشف ودرجة الحموضة (pH)

. فيما يتعلق بدرجة حموضة الطور المتحرك، يمكن القول إن التقدم في تكنولوجيا أعمدة الكروماتوغرافيا السائلة جعل من الممكن استخدام درجة الحموضة كأداة انتقائية حقيقية لفصل المركبات القابلة للتأين. يفضل استخدام أعمدة قوية ميكانيكيًا وعالية الكفاءة وتعمل ضمن نطاق واسع من درجات الحموضة.

المركبات الحمضية يتم الاحتفاظ بها بشكل أكبر عند درجة حموضة منخفضة، بينما المركبات القاعدية يتم الاحتفاظ بها بشكل أكبر عند درجة حموضة مرتفعة (بينما المركبات المحايدة لا تتأثر). عند قيم الحموضة التقليدية المستخدمة (pH 4-8)، فإن تغيير طفيف في درجة الحموضة قد يؤدي إلى تغيير كبير في الاحتفاظ بالمركبات.

بالنسبة للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، يمكن استخدام أوضاع مختلفة للكروماتوغرافيا (الطور العادي أو المعكوس، مزدوج الأيونات أو HILIC) واستخدام كاشف تشتت الضوء (LSD) المتصل بـ HPLC لمراقبة المركبات التي لا تمتص الضوء في منطقة الأشعة فوق البنفسجية/المرئية. يمكن استخدام الكروماتوغرافيا الغازية فقط عندما لا ينتج عن العينة تحلل حراري إضافي (حيث يعمل مدخل العينة على درجات حرارة عالية).

استخدام HPLC المتصل بكاشفات الدايود المصفوفي (DAD) في تحقيق نقاء القمم عادةً ما يعطي نتائج معقولة، ترتبط بشكل رئيسي بالتحديد الموثوق للمكون النشط الرئيسي. يمكن ضمان عدم حدوث تداخل مع قمم التحلل والشوائب الأخرى. الميزة الرئيسية لكاشفات DAD هي القدرة على جمع أطياف عبر نطاق من الأطوال الموجية عند كل نقطة بيانات يتم جمعها عبر القمة، ومن خلال التلاعب بالبرمجيات باستخدام الجبر المتجهي متعدد الأبعاد، يمكن مقارنة كل الأطياف لتحديد نقاء القمة. بهذه الطريقة، يمكن لكاشفات DAD التمييز بين الفروقات الطيفية والكروماتوغرافية التي لا يمكن ملاحظتها بسهولة عبر مقارنات التراكب البسيطة.

كاشفات DAD قد تكون محدودة في بعض الأحيان، فكلما كانت الأطياف أكثر تشابهًا وكان الامتصاص النسبي أقل، كان من الصعب تمييز المركبات المتداخلة. كاشف الطيف الكتلي (MS) يتغلب على العديد من هذه القيود. يمكن أن يوفر كاشف الطيف الكتلي معلومات حول نقاء القمة، والكتلة الدقيقة، والمعلومات الهيكلية والكمية بناءً على نوع الجهاز المستخدم.

الخطوة 3: التحقق من الطريقة Method validation

التحقق ليس طريقة فعالة لتطوير الطريقة، لذا ينبغي تكريس الجهود لخطوة الانتقائية في الطريقة، والعمل مع العينات المتعرضة للإجهاد. قد تبدأ عملية التحقق ببروتوكول يعتمد على دساتير الأدوية و/أو إرشادات ICH (Q2B).  بالنسبة لإجراءات التحليل التي تهدف إلى قياس المادة المطلوب تحليلها في عينة معينة، ينبغي النظر في عناصر التحقق النموذجية: الدقة، التكرارية (التكرار والدقة المتوسطة)، الانتقائية، حدود الكشف والتحديد، المتانة، الخطية والنطاق Specificity, Detection and Quantitation Limits, Robustness, Linearity and Range.